El museo cuenta con quince salas distribuidas en tres plantas. La planta inferior, con dos salas, está dedicada a uniformes militares y arqueología subacuática. La planta principal recoge, en ocho salas, la historia del departamento marítimo de Cádiz, el episodio de la batalla de Trafalgar, la Guerra de la Independencia en la provincia gaditana, la caída del imperio colonial español ocurrida en 1898, la historia de la Escuela de Guardiamarinas y las principales expediciones marítimas y los instrumentos científicos y de navegación que contribuyeron a su desarrollo. Además se puede contemplar una excelente colección vexilológica y el primer mascarón de proa de buque escuela Juan Sebastián Elcano. La planta superior recoge modelos de los más importantes buques nacionales y extranjeros así como varias salas dedicadas a la historia de la artillería naval, a la sanidad militar, al cuerpo de Infantería de Marina y a la historia de la Armada Española durante el siglo XX, con modelos de algunos de sus ejemplares más relevantes como el
Dédalo o el
Príncipe de Asturias entre otros.
Por último el museo expone en la capilla del Palacio de Capitanía, una importante colección de exvotos marineros y de esculturas de los siglos XVIII y XIX procedentes de la iglesia castrense de San Francisco.
El museo alberga en su sede la Biblioteca Naval de San Fernando, con más de 14.000 ejemplares, 4.000 de ellos de carácter histórico.
Visita virtual A través de Google Street View se puede realizar un recorrido por las salas del Museo .